Transfert de gènes dans les cellules de Schwann du nerf sciatique de rongeur par électroporation

Résumé

Source : Ino, D. et. al., Transfert de gènes in vivo vers les cellules de Schwann dans le nerf sciatique de rongeur par électroporation. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre le transfert in vivo de gènes du nerf sciatique de rongeurs vers les cellules de Schwann à l’aide de l’électroporation. Une solution d’ADN plasmidique et de colorant est injectée dans le nerf et des impulsions électriques facilitent l’entrée dans l’ADN. L’ADN s’intègre ensuite dans le génome de la cellule, ce qui permet un transfert de gènes réussi dans les cellules de Schwann.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Génération de

1. plasmides pour l’électroporation in vivo en sous-clonant la séquence d’ADN complémentaire (ADNc) ou d’ARN en épingle à cheveux courte (shRNA) dans un plasmide d’expression pour cellules de mammifères. Utilisez un stimulateur précoce immédiat du cytomégalovirus et un plasmide piloté par le promoteur de la fusion du promoteur de la β-actine (CAG) de poulet, car il permet une expression forte et stable. Pour l’expression des shRNA sous le contrôle d’un promoteur CAG, utilisez un système de cassette shRNA basé sur mir30 pour le sous-clonage du shRNA.
2. Purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de préparation maxi-prep conformément aux instructions du fabricant, et remettez l’ADN en suspension avec une solution saline tamponnée HEPES (140 mM de chlorure de sodium, NaCl, 0,75 mM d’hydrogénophosphate disodique, Na₂HPO₄, 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) ; pH 7,40). Ajustez la concentration d’ADN à ≥4 μg/μl.
3. Préparez la solution d’ADN plasmidique à une concentration de 4 μg/μl et ajoutez une quantité minimale de colorant vert rapide (concentration finale de 0,01 %) pour marquer le site d’injection. Lorsqu’il est nécessaire d’électroporer simultanément plusieurs plasmides, ajuster la concentration totale de la solution d’ADN plasmidique à 4 μg/μl.
   REMARQUE : La composition optimale de l’ADN plasmidique doit être déterminée en fonction de l’efficacité de transfection de chaque plasmide.

2. Stérilisation des instruments chirurgicaux et des

1. instruments chirurgicaux en autoclave salin et de la solution NaCl à 0,9 %.

3. Préparation de la micropipette en verre

1. Tirez les pipettes en verre à l’aide d’un extracteur de pipette. Coupez la pointe de la pipette à un diamètre de 30 à 50 μm. Utilisez les paramètres suivants : Chaleur, 600 ; Vitesse, 50 ; Temps, 75.

4. Chirurgie animale, injection d’ADN et électroporation

REMARQUE : Une vue d’ensemble de cette étape est décrite à la figure 1. Bien que la procédure pour les ratons soit décrite ici, la méthode est également applicable à des animaux plus matures utilisant la même procédure.

1. Anesthésier le rat avec de l’isoflurane dans la boîte d’induction jusqu’à ce que l’animal devienne immobile en ajustant le débit d’oxygène à 0,4 L/min et la concentration d’isoflurane à 4 % (vol/vol). Effectuez un pincement des orteils pour confirmer une anesthésie correcte.
2. Placez le rat sur le réchauffeur préchauffé sous un microscope binoculaire et maintenez l’anesthésie en administrant continuellement de l’isoflurane à travers le masque facial. Ajustez le débit d’oxygène à 0,2 L/min et la concentration d’isoflurane à 2 % (vol/vol). Utilisez des gouttes ophtalmiques pour prévenir la sécheresse oculaire si les yeux de l’animal sont ouverts.
3. Fixez les jambes avec du ruban chirurgical.
4. Nettoyez la peau de la cuisse postérieure avec de la povidone iodée et faites une incision avec un scalpel
   REMARQUE : Rasez les zones chirurgicales si elles sont couvertes de poils.
5. Exposez le nerf sciatique en créant une ouverture entre le muscle quadriceps fémoral et le muscle biceps fémoral à l’aide d’aiguilles à coudre.
6. Mouillez le nerf avec une solution de NaCl à 0,9 %. Absorbez l’excès d’eau avec du papier non pelucheux.
7. Insérez la base d’une micropipette en verre dans un tube flexible et versez la quantité adéquate de solution d’ADN (au moins un microlitre) dans la micropipette en aspirant doucement.
8. Soulevez le nerf exposé en tirant doucement sur le côté distal du nerf à l’aide d’une aiguille.
   REMARQUE : N’appliquez pas de tension sur le nerf pour minimiser les contraintes mécaniques.
9. Insérez la micropipette en verre dans le site distal du nerf et injectez la solution d’ADN en appliquant une pression (c’est-à-dire en soufflant dans l’extrémité ouverte du tube flexible). Injectez la solution d’ADN jusqu’à ce que le nerf apparaisse vert (1 μl maximum). Étant donné que l’insertion fréquente de la micropipette peut endommager le nerf, n’insérez pas la micropipette plus de deux fois.
10. Placez une électrode de platine de type pince à épiler à environ 1 à 2 mm du nerf. Remplissez l’espace entre l’électrode et le nerf avec une solution de NaCl à 0,9 %.
    REMARQUE : Ne tenez pas le nerf avec l’électrode pour éviter un stress mécanique sur le nerf.
11. Appliquez des impulsions électriques sur le site d’injection à l’aide d’un électroporateur muni de l’électrode. Après la première série d’impulsions, inversez l’électrode et appliquez une autre série d’impulsions. Utilisez les paramètres suivants : tension, 50 V ; durée d’impulsion, 5 ms ; intervalle d’impulsion, 100 ms ; nombre d’impulsions, 4 fois.
12. Nettoyez le site d’électroporation avec une solution de NaCl à 0,9 %.

5. Post-électroporation

1. : Fermez les incisions avec de la colle cyanoacrylate.
2. Après avoir séché la colle, nettoyez la plaie avec de la povidone iodée.
3. Relâchez le chiot du masque facial. Réchauffez le chiot sur un réchauffeur pendant au moins une heure afin de lui permettre de se remettre complètement de l’anesthésie.

Résultats

Figure 1 : Schéma de la méthode d’électroporation in vivo. Tout d’abord, le nerf sciatique du rat anesthésié est exposé. Deuxièmement, l’ADN plasmidique est injecté dans le nerf sciatique. Troisièmement, les impulsions électriques sont délivrées...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Genopure plasmide Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Kit de purification de l’ADN plasmidique
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Colorant pour injection d’ADN
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Verre capillaire
Tube d’aspiration	Drummond	05-2000-00	Tube d’aspiration pour micro-injection
MODÈLE P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	Extracteur
CUY21 Électroporateur	BEX	cellule unique CUY21	Générateur d’impulsions
Réchauffeur électrique	KODEN	CAH-6A	Réchauffeur pendant l’opération
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anesthésique

de micropipette à à cellule unique